Wednesday, January 22nd, 2014
Topik : Ultrasonic Cell Distruption Judul :
Author :
Latar Belakang : Ragi adalah sel tunggal dari ukuran 5 sampai 10 um dan ukuran bulat atau oval, mereka dikelilingi oleh tebal, kaku, memiliki dinding sel permanen, yang membuat ekstraksi sulit untuk mendapatkan produk intraseluler yang diinginkan. Satu dapat menggunakan pencernaan enzimatik atau hidrolisis tetapi mereka dapat mempengaruhi protein. Kemungkinan lain adalah dengan menggunakan perusakan mekanik, menerapkan proses seperti manik-manik penggilingan, pengobatan tekanan tinggi atau sonikasi. Yang populer adalah manik penggilingan dengan manik-manik kaca tetapi metode ini melibatkan kondisi yang keras, yang dapat menyebabkan denaturasi protein dan penurunan yield. Dalam karya ini mempertimbangkan metode selanjutnya disonikasi untuk Lysing sel. Metode ini biasanya digunakan untuk mengobati sampel kecil, mudah untuk diterapkan dan cepat, efisien. Gangguan sel adalah unit operasi yang diperlukan untuk isolasi senyawa biologis intraseluler yang tidak disekresikan oleh cell.Metode yang digunakan untuk gangguan sel dapat diklasifikasikan sebagai mekanik (menggunakan geser kekuatan) dan non-mekanik (termasuk fisik, kimia dan perawatan enzimatis) . antara metode mekanik, ultrasonication adalah salah satu yang paling banyak digunakan metode gangguan laboratorium (disintegrators Ultrasonic). Sonikasi merupakan salah satu yang paling umum digunakan meskipun nyatanya tidak berguna untuk industri pur-pose. Sonikasi secara luas digunakan untuk melepaskan protein dari sel E. coli , studi paling lengkap pada gangguan sel dengan sonikasi telah dilakukan dengan menggunakan model sel lain seperti ragi dan bakteri gram positif seperti Arthrobacter simplex. Sebaliknya, gangguan sel E. coli telah secara umum diteliti dan hanya beberapa studi tentang topik ini yang tersedia. Karena, dalam pengalaman penelitian tersebut, khasiat sonikasi telah sering digunakan untuk mendapatkan jumlah protein fusi yang mencukupi dari bahan sel yang terbatas, dilakukan penelitian kinetika pelepasan protein selama ultra- sonication dari E. coli dan pengaruh parameter penting pada kedua sel gangguan dan aktivitas enzim.
Tujuan :
1. Untuk memprediksi distribusi tekanan akustik dalam sistem dilengkapi dengan disintegrator ultrasonik dan pengaruh parameter geometris lainnya pada rilis protein sepakat dengan model prediksi CFD
2.Untuk menyelidiki efek ultrasonication pada pelepasan protein kinetika sel ragi roti . dan untuk meningkatkan gangguan sel lebih lanjut dengan menambahkan kaca manik-manik.
3. Untuk memudahkan pembentukan kondisi yang optimal dan waktu sonikasi dan pelepasan cepat dari sejumlah besar protein intraseluler, baik asli atau rekombinan, dalam bentuk aktifnya .
Eksperimental (Material) :
èJurnal 1 Pemodelan Acoustic Pressure Lapangan Dalam proses sonikasi dinding sel mengalami gangguan yang menyebabkan kerusakan pada dinding sel yang dikarenakan gaya geser yang sangat tinggi yang disebabkan oleh gelembung kavitasi yang dihasilkan oleh gelombang ultrasonik. gelombang ultrasonik yang merambat ke dalam medium cair dari permukaan emitor oleh gelombang tekanan yang secara berkala memperluas dan kompres media, yang dapat membuat lokal microbubbles kavitasi transien. Skema diagram dari set-up yang diterapkan dalam percobaan dan geometri sel sonication disajikan pada Gambar 1. Distribusi tekanan akustik dapat diperoleh dengan memecahkan persamaan gelombang Penyelidikan eksperimental dilakukan dalam sistem disajikan pada Gambar 1 di mana p adalah tekanan akustik dan c adalah kecepatan suara. Dengan asumsi bahwa tekanan akustik adalah waktu harmonik, (r,t) = p (r)e, (1) persamaan Helmholtz dengan ω menjadi frekuensi angular (sudut), dan k jumlah gelombang, ω = kc. Tekanan sesaat kemudian dapat dihitung dari bidang amplitudo tekanan, P:
Percobaan Jurnal 2 PengukuranProtein
Konsentrasi ditentukan oleh metode Lowry menggunakan albumin serum bovine sebagai standar. Total protein dalam sel ragi suspensi diukur setelah basa hidrolisis, dicapai dengan menginkubasi sel di c = 0,05 mol L-1 sodium hidroksida pada 90 ° C 10 min.
Prosesultrasonik Percobaan dilakukan menggunakan Bandelin Sonopuls HD 2200 sonikator di berbagai kekuatan akustik (20-140 W) dan siklus (10-80%). Suhu ragi larutan harus diperiksa dan dijaga konstan dengan menggunakan penangas pendingin yang mengandung etilena dengan campuran glikol dan air.
Komputasi Menggunakan Paket perangkat lunak MATLAB 5.0 alat ini digunakan untuk perhitungan numerik. Parameter yang dievaluasi dengan metode kuadrat terkecil nonlinier.
Percobaan Jurnal 3 Prosedur sonication Sel-sel yang dipanen oleh sentrifugasi, dioptimalkan dahulu untuk menjaga stabilitas protein b – Galac – tosidase fusi dalam ekstrak sel. Sonikator sel ( Braun Labsonic U ) dilengkapi dengan probe jarum titanium ( 40 T ) dari 4 – mm diameter dan panjang 127 direndam sekitar 5 mm dalam sampel. Sisa Sonikasi dilakukan pada 20 kHz dan kekuatan akustik berkisar antara 35 dan 95 W. Sampel volume variabel ditempatkan di U – berbentuk tabung silinder 2,2 – cm diam – eter , dan disimpan dalam sebuah bak garam – es selama sel gangguan untuk mencegah overheating . Karena generator ultrasonik per – mits kontrol siklus gelombang, menggunakan opsi ini untuk mengurangi pembentukan radikal bebas. sonikasi digambarkan dalam angka dan yang digunakan dalam persamaan mewakili dua sampel waktu yang sebenarnya diserahkan ke dampak ultrasonik.
b–galaktosidase Assay Aktivitas enzim b-galaktosidase intraseluler ditentukan menurut metode Miller dan lisis sel dimediasi oleh SDS-kloroform. sampel diinkubasi untuk memungkinkan lisis sel. Aktivitas protein rekombinan dilepaskan dari sel sonicated ditentukan dengan prosedur yang sama tetapi tanpa lisis sel sebelumnya.
Western Blot Pada saat sonikasi yang berbeda, sampel 50-ml diambil dan disentrifugasi pada 14.000 rpm selama 1 menit. Pelet diresuspensi dalam 20 mL sonikasi penyangga dan disentrifugasi lagi. Supernatan ditarik dan direbus. Setelah berjalan, imunoblotting yang dilakukan dan band protein yang immunode dideteksi menggunakan poliklonal anti-b galaktosidase serum. Band daerah ditentukan oleh scanning dan analisis lebih lanjut dari lembaran nitroselulosa dengan BioImage Cerdas Quanti-fier ™ perangkat lunak.
Hasil dan Pembahasan
Jurnal 1 K merupakan pelepasan protein konstan. Gambar 9a menunjukkan bahwa bentuk eq. setuju dengan data eksperimen, yang memungkinkan identifikasi rilis protein konstan. Jurnal 2 Release protein meningkat dengan meningkatkan kekuatan akustik sebagai lipatan daya akustik menyebabkan gangguan yang lebih tinggi. Di sisi lain, pengolahan waktu menurun dengan meningkatkan daya akustik Jurnal 3 Western plot analisis sampel serial mengungkapkan peningkatan progresif anti β-galactosidase immunoreactive protein selama sonication. B menggambarkan ekstraseluler enzim dan β-galactosidase aktivitas selama percobaan standar sonication, terlihat pada tahap awal sonication Dengan demikian, ukuran β-galactosidase aktivitas enzim adalah metode yang tepat untuk memantau enzim ekstraseluler, karena aktivitas enzim terkait dengan sel-sel permeabilized tapi nondisrupted tidak terdeteksi.
Jurnal 2 Hasil penelitian menunjukkan daya akustik yang tinggi tidak layak untuk gangguan karena peningkatan energi jauh lebih cepat, yang tidak sebanding dengan waktu yang disimpan.
Jurnal 3 Model yang terintegrasi untuk pemulihan protein Hasil ini menunjukkan bahwa resistansi untuk sonication-mediated disintegrasi sel bakteri di bawah kondisi yang sama dapat bervariasi sedikit di antara galur berbeda dari sebuah spesies bakteri. nilai h harus ditentukan untuk setiap spesifik ketegangan jika sebuah proses yang sangat akurat diperlukan. Karena pelepasan β-galactosidase asimtotik, itu akan menarik untuk mengetahui berapa lama suspensi sel harus sonicated untuk mendapatkan sejumlah besar ekstraseluler protein. Nilai s bisa diperoleh dengan membandingkan data aktual dari serangkaian percobaan kontemporer dengan pola kumpulan data dan menggunakan sebuah meralatku nilai dari pn
Jurnal 1 Pengaruh kondisi proses pada efisiensi dari gangguan ultrasonik diselidiki dengan mengukur jumlah protein terlarut dilepaskan. Konsentrasi protein yang dilepaskan ke fasa air dari sel-sel ragi yang sudah hancur diukur dengan menggunakan metode Lowry.Hasil percobaan berikut Gambar 6 dan 7: Gambar 6. Pengaruh posisi ujung tanduk dan amplitudo pada konsentrasi protein, V = 75cm3 , DT = 48 mm, dH = 13 mm, f = 20 kHz, waktu proses = 180 s, saring 1 dari Saccharomyces cerevisiae. Gambar 7.menunjukkan efek dari tanduk ujung posisi dan diameter sel sonikasi pada rilis protein. Pengaruh posisi ujung tanduk dan diameter sel sonikasi konsentrasi protein, V = 90cm3 DT = 48 mm, dH = 13 mm, f = 20 kHz, A = 62 pM waktu proses = 180 s, saring 2 dari S. cerevisiae Jurnal 2 Gambar. 5a dan 5b menunjukkan bahwa energi dan waktu untuk gangguan bisa berkurang jauh dengan menggunakan kaca manik-manik. Dengan kata lain, efisiensi gangguan dan tingkat siklus akustik yang lebih tinggi dapat dicapai dengan menggunakan manik-manik kaca dengan tingkat akustik yang lebih rendah.
Jurnal 3 Pelepasan asli β-Galactosidase dari budaya (culture) induksi IPTG Peningkatan pesat dari aktivitas β-galactosidase selalu diamati selama yang pertama menit (gambar 1.a).Pelepasan rate ini, namun, yang membusuk lebih lanjut dan unit enzimatik mencapai hampir konstan setelah nilai-nilai pendek sonication waktu, bahkan dalam strain rekombinan yang berbeda dan protein Akibatnya, memperlambat peningkatan aktivitas β-galactosidase yang ditunjukkan dalam gambar 1 bisa dihubungkan secara eksklusif untuk penurunan jumlah sel-sel yang terganggu selama sonication. dimana β gal mewakili unit enzimatik dirilis, β galmax unit enzimatik dalam sampel yang dapat dilepaskan oleh sonication, t sonication waktu, dan k nilai konstan empiris ditentukan oleh setiap set sonication kondisi.
Analisis faktor-faktor yang mempengaruhi Sonication-dimediasi Protein pemulihan dari E. coli
Dalam percobaan ini, nilai-nilai masing-masing empat parameter ini dipilih dalam rentang eksperimental yang dicapai. Dari nilai-nilai yang diperoleh untuk aktivitas enzim, kami lebih lanjut mempelajari evolusi dari nilai konstan k menurut EQ (1), dan hasil yang disajikan dalam gambar 3. Konsentrasi sel maupun ionik kekuatan pengaruh k, sedangkan ketergantungan yang kuat pada kekuatan akustik, dan terutama dari volume sampel, diamati. Dalam sebuah perbandingan percobaan dengan budaya CGSC5073 dalam salah satu LB atau M9 media minimal di 50-w kekuasaan akustik, kami telah diperoleh k nilai-nilai dari 0.0508 dan 0.0334, masing-masing, menunjukkan sebuah lebih cepat melepaskan dalam sel ditanam di kaya. menengah.Semakin kecil ukuran sel di bawah kondisi seperti itu bisa account untuk sebuah sel yang lebih tinggi kekuatan
Kesimpulan
Jurnal bisa di download di berikut ini
jurnal 1 for bioseparasi bismillah (Distruption Of Yeast Cells With Ultrasound)
jurnal 2 (Protein Releasing Kinetic of Bakers’ Yeast Cells by Ultrasound)
jurnal 3 (Optimized Release of Recombinant Proteins by Ultrasonication of E. coli Cells)
by :
Tirnisa / UB
Leave a Reply